分光光度法是指应用分光光度计的分析方法，因其具有灵敏、准确、快速及选择性好等特点被广泛应用于实验室的元素分析，分光光度计的使用虽然简单，但是其原理及一些基础知识想必有许多小伙伴也是不了解的，今天整理了一部分分享给大家，希望能对你有所帮助。

  原理

  1、物质对光的选择性吸收

  当光束照射到物质上时，光与物质发生相互作用，产生反射、散射、吸收或透射。若被照射的是均匀溶液，光的散射可以忽略。

      (1)溶液颜色的产生

  当一束白光通过某一有色溶液时，一些波长的光被溶液吸收，另一些波长的光则透过溶液。透射光或反射光刺激人眼使人感到颜色的存在。人把自身能感觉到的光定义为可见光。在可见光区，不同波长的光呈现不同的颜色，因此溶液的颜色由透射光的波长所决定。透射光与吸收光可组成白光，故称这两种光互为补色光，两种颜色互为补色。

  (2)光吸收的本质

  当一束光照射到某物质或其溶液时，组成该物质的分子、原子或离子与光子发生“碰撞”，光子的能量就转移到分子、原子或离子上，是这些粒子由最低能态(基态)跃迁到较高能态(激发态)，这个作用称为物质对光的吸收。

  被激发的粒子约在10-8s后回到基态，并以热或荧光等形式释放出能量。分子、原子或离子具有不连续的量子化能级，仅当照射光光子的能量hυ，与被照射物质粒子的基态和激发态能量之差相当时，才能发生吸收。不同物质微粒由于结构不同而具有不同的量子化能级，其基态和激发态能量差也不相同。所以物质对光的吸收具有选择性。

  (3) 吸收曲线

  吸收曲线，也称为吸收光谱，描述了物质对不同波长的光的吸收能力。将不同波长的光透过某一固定浓度和厚度的有色溶液，测量每一波长下有色溶液对光的吸收程度(即吸光度)，然后以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标作图，绘制的曲线即为吸收曲线。

  不同浓度的同一物质，在吸收峰附近的吸光度随着浓度增加而增大，但最大吸收波长不变。若在最大吸收波长处测定吸光度，则灵敏度最高。因此，吸收曲线是分光光度法中选择测定波长的重要依据。

  2、光吸收基本定律

  即朗伯-比尔定律：

  当一束平行单色光通过液层厚度为b的有色溶液时，溶质吸收了光能，光的强度就要减弱。溶液的浓度越大，通过的液层厚度越大，入射光越强，则光被吸收的越多，光强度的减弱也越显著。该定律是紫外可见分光光度法等各类吸光光度法定量分析的依据，是由实验观察得到的，不仅适用于溶液，也适用于其他均匀非散射的吸光物质。

  A=lg(I/I0)=εbc

  A-吸光度;

  I0-入射光强度，cd;

  I-透射光强度，cd;

  ε-吸光系数，L/(mol˙cm);

  b-液层厚度(光程长度)，cm;

  c-有色溶液的浓度，mol/L。

  其物理意义为：当一束平行单色光通过单一均匀、非散射的吸光物质溶液时，溶液的吸光度与溶液浓度和液层厚度的乘积成正比。

  式中ε是吸光物质在特定波长和溶剂的情况下的一个特征常数，数值上等于浓度为1mol/L的吸光物质在1cm光程中的吸光度。ε是吸光物质吸光能力的量度，ε值越大，方法的灵敏度越高。由实验结果计算ε时，常以被测物质的总浓度代替吸光物质的浓度，实际上时表观摩尔吸光系数。在多组分体系中，如果各种吸光物质之间没有相互作用，体系的总吸光度等于各组分吸光度之和，即吸光度具有加和性。

  透光度T是透射光强度I与入射光强度I0之比，即：

  T=I/I0

  因此：A=lg(1/T)

  主要部件

  尽管光度计种类型号繁多，但它们都是由相同的基本部件组成的，包括光源、单色器、吸收池和检测系统。

  1、光源

  在测量吸光度时，要求光源发出所需波长范围内的连续光谱，要具有足够的光强度，并在一定时间内能保持稳定。

  在可见光区测量时，通常使用钨丝灯作为光源。钨丝加热到白炽状态时会发出波长在320~2500nm之间的连续光谱。钨丝灯工作温度一般为2600~2870K，熔点为3680K。钨丝灯的温度决定于电源电压，电源电压的微小波动会引起钨灯光强度的很大变化，因此必须使用稳压电源。

  在紫外区测量时，常采用氢灯或氘灯产生波长在180~375nm之间的连续光谱作为光源。其理想光源应具有覆盖整个紫外可见光区的连续辐射，强度应比较高，且随波长变化能量变化不大，但在实际上难以实现。氘灯辐射强度比氢灯高2~3倍，寿命也比较长。氙灯的强度一般高于氢灯，但欠稳定，波长范围180~1000nm，常用作荧光分光光度计的激发光源。

  2、单色器

  单色器是将光源发射的复合光分解为单色光的装置。

  一般由5部分组成：入光狭缝、准光气(一般由透镜或凹面反光镜使入射光成为平行光束)、色散器、投影器(一般由一个透镜或凹面镜将分光后的单色光投影至出光狭缝)、出光狭缝。

  色散器是单色器的核心部分，常用的色散元件是棱镜或光栅。

  棱镜由玻璃或石英制成，玻璃棱镜色散能力强，但吸收紫外光，只能用于350-820nm波长的分析测定，在紫外区必须用石英棱镜。

  光栅的特点是：色散均匀，呈线性，光度测量便于自动化，工作波段广。

  3、吸收池

  也称为比色皿，是盛放样品溶液的容器，具有两个互相平行、透光且具有精确厚度的平面。

  玻璃吸收池光程长度一般为1cm，也有0.1-10cm的。

  由于吸收池厚度存在一定误差，其材质对光不是完全透明，在做定量分析时，对吸收池应做配套性试验，试验后标记出放置方向。

  紫外光区数值不跳为石英。

  4、检测系统

  检测系统包括检测器和记录显示装置。

  检测器是一种光电转换设备，将光强度转变为电信号显示出来。

  常用的检测器有光电池、光电倍增管和光二极管阵列检测器等。

  光电池的光电流较大，不用放大，用于初级的分光光度计上，疲劳效应严重。

  光电倍增管利用二次电子发射来放大光电流，放大倍数可高达108倍，应用最为广泛。

  光二极管阵列检测器由于全部波长同时被检测，扫描速度快，可在0.1s内完成对190-800nm波长范围的扫描。

  记录显示装置包括放大器和结果显示装置。70年代采用数字读出装置。现代在主机中装备有微处理机或外接微型计算机，控制仪器操作和处理测量数据，装有屏幕显示、打印机和绘图仪等。